F-PHFA法は、類似の塩基配列をもち、鎖長がまったく同じ2種類の2本鎖DNAの混合物において、変性したあと比較的緩やかな温度勾配によるアニーリングを行うと完全に相補的な2本鎖が優先的に形成されるという性質を利用したもので、PCR産物中のわずか1塩基の違いをFRET（fluorescent resonance energy transfer）を利用して簡便かつ再現性よく検出できます。

PCRにより調製された２本鎖のアンプリコンと２本鎖の標識DNAを混合し、熱変性によりDNAをすべて解離させて一本鎖の状態にします。その後、緩やかに温度を下げて競合的ハイブリダイゼーションを行います。アンプリコンと標識DNAの配列が完全に一致する場合（図のB）、競合的ハイブリダイゼーションに伴い、大過剰にあるアンプリコンが標識DNAを希釈し、もとの２本鎖標識DNAがほとんど形成されません。結果としてFRETは観察されず、FAMは光り続けます。一方、アンプリコンと標識DNAが一塩基異なる場合(図のA)、アンプリコンと標識DNAのTm値が一致しないために、アンプリコンと標識DNAの鎖置換よりも優先的に標識DNAはもとの二本鎖を形成し、結果としてFRETが起きます。すなわち、ハイブリダイゼーションに伴い、FAMの蛍光は消光していきます。図中のグラフは蛍光測定のイメージ図であり、横軸は温度、縦軸はFAMの蛍光強度を示します。変異型を識別する標識DNAと変異型のアンプリコン(緑線)あるいは野生型のアンプリコン(青色)との反応を模式的に示したものです。